• از عزیزانی که قصد ثبت نام در سایت را دارند درخواست می گردد ابتدا قوانین و مقررات را مطالعه فرمایند

بی بی کد بررسی خطای میتوزی در سلولﻫﺎی کالوس گیاه Alyssum inflatum( تیرهﻯ شبﺑو)

#1
بررسی خطای میتوزی در سلولﻫﺎی کالوس گیاه Alyssum inflatum( تیرهﻯ شبﺑو)
طیبه صالحی مبارکه (دبیر زیست شناسی منطقه مبارکه)
Mitotic error checking in callus cells Alyssum inflatum (Brassicaceae)

Mobarakeh Salehi-Tayebeh (biology teacher Mobarakeh region)

With tips
Doctor Rasoul ghasemi- Assistant Professor Department of Biology, Faculty of Science, Payam Noor University, Tehran, Iran

چکیده
تیره شب بو(Brassicaceae) شامل 338 جنس و بیش از 3713 گونه در دنیاست که 170 گونه‌ی آن در جنس Alyssum قرار دارند.فنوتيپﻫﺎیی با ويژگي متمايز در این جنس جنبهﻯ دارویی، صنعتی و غذایی داشته و به پاکسازی محیط زیست در مناطق صنعتی آلوده به فلزات سنگین كمك میﻛند. نتایج حاصل از این تحقیق مشخصﻛرد که گونهﻯ دیپلوئید ( 2n=16) Alyssum inflatumدارای فرمول کاریوتایپی 6M+m+T
بوده و از نظر تنوع کاریوتایپی در محیط کشت بافت به کمک مادهﻯ شیمیایی اتیل متان سولفانات، سلولﻫﺎیی پلیﭘﻠﻮئید از این گونه حاصل شد که در بین آنها سلولﻫﺎیی تتراپلوئید 32 =4n وجود داشتند. میزان غلظت بهینه برای تغییر تعداد کروموزوم توسط مادهﻯ شیمیایی اتیل متان سولفانات ١٥ تا ۲۵ میلی مول در لیتر، پس از واکشت کالوسﻫﺎ ﺑﻪ دست آمد.


کلید واژهﻫﺎ: آلیسوم، براسیکاسه، کاریوتایپ، کالوس، اتیل متان سولفانات، تتراﭘلوئید


مقدمه
در تحقيقات به نژادي انجام مطالعات سيتولوژيكي از اقدامات اوليه است، زيرا شناخت تعداد كروموزومﻫﺎ در انتخاب روشﻫﺎي به نژادي مؤثر است. تعيين سطح پليﭘلوئيدي كه از مطالعات كروموزومي به دست ميﺁيد در انجام دو رگهﮔيري از اهميت فراواني برخورداراست. از كاربردهاي ديگر مطالعهﻯ كروموزومي شناسايي و طبقهﺑندي گياهان است. تنوع زياد در كروموزومﻫﺎ و تنوع تعداد، اندازه و ساختمان كروموزوم شاخص مفيدي براي اهداف تاكسونوميكي است (Hieter and Griffiths, 1999). گرچه همانندسازي و رونويسي از DNA در يوكاريوتها پديدهﺍي وسيع و مشخص است، اما گاهي تغيير در تعداد كروموزومﻫﺎ باعث ايجاد تنوعاتي بين گونهﻫا می‌شود كه نقش مهمي در مطالعهﻯ تكامل سلولي دارد 2000),Godfrey and Masters). مواد شيميايي بازدارندهﻯ ميتوز از طريق ايجاد دخالت بازدارندگي در تشكيل دوك تقسيم مانع از مهاجرت قطبي كروموزومها در تقسيم سلولي شده و باعث ايجاد سلولﻫﺎیی با تعداد كروموزوم دو برابر ميﺷوند و بدين ترتيب تنوع گونهﺍي به ﻭجود ميﺁورند. يكي از روشﻫﺎي ايجاد تنوع فنوتيپي در گياهان، توليد گونهﻫاي پليﭘلوئيدي ميﺑاشد. بخش‌هاي رويشي گیاه که از طریق کشت بافت تکثیر می‌شوند تغییرات ژنتیکی بالایی را نشان می‌دهند. می‌دهند و این تغییرات ناشی از کشت بافت می‌تواند تنوع ژنتیکی جدیدی را در اختیار اصلاح کنندهﻯ نباتات قرار دهد. تغييراتي كه بر روي كروموزومﻫﺎ انجام مي‌شود شامل: تفاوت در اندازهﻯ كروموزوم، موقعيت سانترومر، تعداد و موقعيت ساتليت، تفاوت در درجهﻯ فشردگي هتروكروماتين و تعداد كروموزومﻫﺎ (پليﭘلوئيدي) ميﺑاشد. تغيير سطح پليﭘلوئيدي گياهان در كشاورزي و باغباني كاربرد گسترده دارد .(White, 1973) آنالیزهای دینامیک کروموزوم پروفاز در چند گونه از جمله ذرت نشان میﺩهد که نیروهای فیزیکی مسئول حرکات کروموزومی، در اسکلت سلولی سلولی ایجاد میﺷوند که به پوشش هستهﺍی منتقل می گردند و سپس به واسطهﻯ اتصال تلومر به پوشش هستهﺍی به پایانهﻫﺎی کروموزومی منتقل میﺷوند. تیمار بساکﻫﺎی ذرت با داروهای مختل کنندهﻯ اسکلت سلولی، مانند کلشیسین که مانع پلیمریزاسیون توبولین میﮔردد و لاترونکولین B که بازدارندهﻯ پلیمریزاسیون اکتین است منجر به توقف کامل حرکات کروموزومی پروفاز و همچنین حرکات پوشش هستهﺍی که همراه با جنبش کروموزوم است میﮔردد. این دادهﻫﺎ نشان میﺩهند که سیتواسکلتﻫﺎی اکتین و توبولین نقش مهمی در دینامیک کروموزومی پروفاز میوزی ایفا میﻛنند. (Sheehan and Pawlowski, 2009).
مواد و روشﻫﺎ
در این مطالعه گونهﺍی از جنس Alyssum، که بومي خاکﻫﺎي سرپنتين غرب ايران و بومی مناطق جنوب اروپا بود جمعﺁوری و جهت تهیهﻯ کاریوتایپ از مریستم انتهایی ریشهﻯ آنها استفاده شد. پس از رشد ریشهﻫﺎ، برای تهیه سلولﻫﺎی مناسب در حال تقسیم میتوزی، انتهای ریشهﻫﺎ را به طول نیم تا یک سانتیﻣتر جدا و در محلول مورد نظر به مدت 2/5 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد پیشﺗیمار شدند. آلفا برومونفتالین به عنوان پیش تیمار و برای تثبیت از محلول لویتسکی(اسيد کروميک 1% + فرمالدئيد 10 % با نسبت برابر) استفاده شد. آنها را در الکل اتیلیک ۷۰% در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری نمودیم. پس از خارج کردن ریشه‏ها از محلول ثبوت یا الکل 70% و پس از چندین بار شستشو با آب مقطر نمونهﻫﺎ در مادهﻱ هیدرولیز کنندهﻱ NaOH یا HCl یک نرمال در دمای 60 درجهﻱ سانتیگراد بن ماری به مدت 20 دقیقه قرار داده شدند. ریشه‏ها به مدت 24-16ساعت در دمای اتاق در رنگ استوآيرون هماتاکيسيلين و یا لاکتو پروپیونیک اسیدقرار گرفتند. سپس اضافی رنگ ریشه‏ها با شستشو با آب مقطر زائل شد. پس از شستشو با آب مقطر، اسکواش نمونهﻫﺎ به کمک محلول 45% اسید استیک بر روی لام انجام شد.
برای عکسﺑرداری از کاریوتایپ نمونهﻫﺎی مختلف از سیستم مانیتورینگ استفادهﺷد و تصاویر از طریق دوربین ویدیویی Nikon که بر روی میکروسکپ نوری نصب شد به مانیتور ضبط و منتقل گردید. اندازهگیری کروموزومﻫﺎ جهت تهیهﻯ توسط نرم افزاری 3.3Micro Measure versionانجام شد.فرمول کاریوتایپی گونهﻯ مورد مطالعه به روشLevan (1964) تعيين گرديد.

بحث
یکی از ناهنجاریﻫﺎﻯ عددی که در طی میتوز اتفاق میﺍفتد احتمال افزایش یا کاهش تعداد دستهﻫﺎی کروموزومی است. تاثیر یک عامل فیزیکی و شیمیایی گاهی باعث عدم جدایی یک جفت کروموزوم همولوگ شده و این کروموزومﻫﺎ به صورت جفت وارد یک سلول شدهﺍند. به این نوع تغییر کروموزومی یوپلوئیدی میﮔویند که تغییرات کروموزومی به صورت مضرب صحیحی از مجموعه کروموزومی نمایان میﺷود Badea and Raicu, 1984)). مانند سلول تتراپلوئید در گونهﻱAlyssum inflatum که گونهﻯ دیپلوئید این گیاه 16 کروموزومی است . القای پلیﭘلوئیدی در سلولﻫﺎی در حال تقسیم میتوز شده واستفاده از این ماده در غلظتﻫﺎی متفاوت و در مدت زمان معین در شرایط مناسب از لحاظ pH و دما در محیط کشت MS باعث تغییر در عدد کروموزومی کالوسﻫﺎ میﺷود and Cook, 2000)(Penmetsa. کاربرد اتیل متان سولفانات در این پزوهش باعث افزایش تعداد کروموزومﻫﺎ و DNAﯼ هستهﺍی شد. این ماده در غلظتﻫﺎی 20،15و25 میلی مول در لیتر کالوسﻫﺎ را بیشتر تحت تاثیر قرار داد. در غلظتﻫﺎی کمتر چندان تغییری مشاهده نشد و غلظتﻫﺎی بالاتر باعث تیرگی و کاهش درصد زندهﻣﺎنی کالوسﻫﺎ شد. مدت زمان تیمار نیز از عوامل موثر بر این تغییرات بود، به طوریﻛﻪ با افزایش تعداد واکشتﻫﺎ در غلظتﻫﺎی مناسب در طول 20 هفته بیشترین درصد پلیﭘلوئیدی مشاهده شد. نتایج آنالیز واریانس در ارتباط با اثر تیمارهای مختلف نشان دهندهﻱ اثر معنیﺩار غلظت اتیل متان سولفانات بر درصد احتمالی کالوس 32 =4n در Alyssum inflatum بود. بیشترین میزان تولید این کالوسﻫﺎ مربوط به غلظت 15 میلی مول در لیتر بود. در غلظت20 و 25 میلی مول در لیتر سلولﻫﺎیی با تعداد کروموزوم متفاوت مشاهده شدند که این تغییرات تحت تاثیر این ماده شیمیایی بود. بعد از غلظت صفر بیشترین احتمال زنده مانی کالوسﻫﺎ در غلظت 5 میلی مول در لیتر و در مدت زمان 4 هفته بوده است. به مرور زمان و با افزایش غلظت اتیل متان سولفانات درصد زندهﻣﺎنی کاهش یافت. با وجود اینﻛﻪ اثر این ماده و همچنین مدت زمان واکشت کالوسﻫﺎ بر میزان کالوسﺯایی و تولید سلولﻫﺎیی با عدد کروموزومی جدید موثر بود اما اثر همﺯمان این دو بر درصد پلیﭘلوئید شدن تاثیر معنیﺩاری نداشت .

نتیجهﮔیری
در این مطالعه در شرایط کشت تغییرات کروموزومی گونهﻯ Alyssum inflatum بررسی شد. شناسایی این تغییرات اهمیت دارد زیرا استفاده از این گیاهان برای هدفﻫﺎیی مانند گیاه پالایی در بسیاری موارد نیازمند تغییرات ژنتیکی در این گیاهان است تا بتوان آنها را در شرایط محیطی مختلف مستقر نمود و یا سایر صفات مورد نیاز را به آنها منتقل نمود.

منابع
Aryavand, A. (1996). Numerical taxonomic study of the Iranian species of Alyssum L. based on morphological characters
Badea, E., Raicu, P. 1984. Culturi de celule si ţesuturi vegetale - aplicaţii în agricultură. Edit. Ceres, Bucureşti: 145-185
Hieter, P. and Griffiths,T.1999. Polyploidy more is more of Less. Scence, 285: 210- 211
Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. A. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52: 201- 220

Penmetsa, R.V. and Cook, D.R. 2000. Production and characterization of diveres developmental mutants of Medicago truncatula. Plant physiology. 123: 1387 – 1398

Sheehan, M. J. and Pawlowski, W.P. 2009. Live imaging of rapid chromosomemovements in meiotic prophase I in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106:20989–20994

White, M.J.D. 1973. The chromosomes. 6th ed, Chapman and Hall, London. P45

Salehi.T,1394. Plant Science Master's Thesis of PNU. Karyotype diversity in several species of the genus Alyssum. 164 pages

 

پیوست ها

بالا